Ottimizzazione di comode macchine PCR in tempo reale

Se si tratta di PCR quantitativa di fluorescenza in tempo reale per la quantificazione del virus e la genotipizzazione SNP, abbiamo bisogno di una macchina PCR con la massima specificità possibile; Se si tratta di un rilevamento di agenti patogeni e mRNA, abbiamo bisogno di alta sensibilità Macchina PCR, quindi come dovremmo ottimizzare questa macchina PCR?

Ecco l'elenco dei contenuti:

l Miglioramento dell'efficienza dell'amplificazione della macchina PCR

l usando primer per macchine PCR in tempo reale per PCR generale

Miglioramento dell'efficienza dell'amplificazione della macchina PCR

Per migliorare la macchina PCR Efficienza, specificità e sensibilità di amplificazione, possiamo ottimizzare la macchina PCR quantitativa in tempo reale per la fluorescenza per l'esperimento attraverso una serie di misure. Il primo è la selezione della sequenza target.

1, la scelta della comoda sequenza target della macchina PCR in tempo reale Lunghezza appropriata tra 50 e 150 bp. Sequenze più brevi richiedono meno tempo per sintetizzare e hanno tempi di amplificazione più brevi, quindi la possibilità di amplificare il DNA contaminante è ridotta.

2, quando si seleziona la sequenza target, utilizzare BLAST Search per analizzare la sequenza target per i polimorfismi ed errori di sequenziamento ed evitarli. Se ci sono sequenze duplicate nella sequenza target, ridurrà la sensibilità di rilevamento di questa macchina PCR e dovrebbe anche essere evitata.

3, Controlla il contenuto GC ≤ 60% nella sequenza target. L'alto contenuto di GC influenzerà la denaturazione della sequenza target nel ciclo termico, ma anche facile da produrre questa amplificazione non specifica della macchina PCR.

4, evitare di generare struttura secondaria. Le sequenze target con sequenze ripetitive inverse sono facili da produrre una struttura secondaria, che influisce sull'ibridazione di convenienti primer e sonde della macchina PCR in tempo reale.

Inoltre, dobbiamo anche garantire che la qualità del modello non influisca sull'amplificazione, i risultati della comoda macchina PCR in tempo reale abbiano affidabilità. Ad esempio, il DNA danneggiato non può essere amplificato adeguatamente nella macchina PCR o non amplificata affatto. Inoltre, la presenza di reagenti inibitori della DNA polimerasi (DMSO, ecc.) E dei contaminanti (SDS, ecc.) Nel modello può influire sull'affidabilità dei risultati dell'amplificazione della macchina PCR.

Utilizzo dei primer per macchine PCR in tempo reale per PCR generale

Ottieni comodo in tempo reale Macchina PCR Primer, questo metodo può essere utilizzato anche per la PCR ordinaria.

1, la lunghezza dovrebbe essere 18-30BP per garantire la specificità del legame.

2, la temperatura di fusione (valore TM) dovrebbe essere di 55-60 ° C e i valori TM dei due primer dovrebbero differire di 2-3 ° C.

3, ogni primer dovrebbe avere da 1 a 3 guanine o citosine all'estremità 3 ', che può ridurre comodamente l'amplificazione non specifica durante la macchina PCR in tempo reale. Più di 3 si ritorcerà contro e causerà un "effetto scorrevole" che porta a un'estensione errata.

4. Il contenuto GC dei primer dovrebbe essere di circa il 50%, il contenuto di GC troppo elevato aumenterà il valore TM.

5, i primer per la macchina PCR dovrebbero evitare sequenze ripetitive inverse, poiché formerà una struttura secondaria, che influenza il legame del primer sul modello.

6, se si tratta di RT-PCR, è anche necessario evitare di progettare primer per legarsi alle sequenze di esone, il che porterà a risultati sperimentali della macchina PCR falsi positivi. L'approccio corretto dovrebbe essere progettato sul lungo fianco intron, o brevi introni o attraverso la regione di giunzione esone-esone.

7. Desalizzare e purificare i primer.

Nota che a volte, quando hai fatto tutti i punti, i primer potrebbero non amplificare, quindi dovresti ridisegnare i primer.

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